La confirmación estructural del aminoácido hialuronato de sodio reticulado (Ácido Hialurónico, HA) requiere una caracterización integral a través de múltiples técnicas analíticas para determinar el sitio de reticulación, el grado de reticulación, el grado de reticulación molecular
Cambio de peso e integridad de la estructura química. Los siguientes son pasos y métodos detallados:
1. Purificación y pretratamiento de muestras
Diálisis / ultrafiltración: elimina los aminoácidos no reaccionados, los agentes de reticulación y los subproductos de pequeñas moléculas.
Liofilización: obtener muestras secas para su posterior análisis.
2. Confirmación de la estructura química
(1) Espectroscopia infrarroja (FT-IR)
Finalidad: confirmar la formación de enlaces de reticulación (como enlaces amida, enlaces éster).
Picos característicos:
Hialuronato de sodio: carboxilato (COO ￫, ~ 1600 cm ￫), hidroxilo (~ 3400 cm ￫).
Después de la reticulación de aminoácidos: nueva banda de amida I (C = O, ~ 1650 cm ￫), banda de amida II (N-H, ~ 1550 cm ￫) o enlace éster (C-O, ~ 1730 cm ￫) se añaden.
(2) Resonancia magnética nuclear (RMN)
H NMR y C NMR:
Detectar las señales de protón / carbono de la espina dorsal HA (ácido glucurónico y N-acetilglucosamina).
Confirme los picos característicos de los aminoácidos (como el alfa-H, grupos de cadena lateral).
Señales de enlace cruzado (como enlaces amida recién formados o enlaces éster).
RMN bidimensional (COSY, HSQC, HMBC): ayuda en la asignación de sitios de enlaces cruzados.
(3) Espectrometría de masas (MS)
MALDI-TOF MS o ESI-MS:
Mida el cambio de peso molecular antes y después de la reticulación para verificar el grado de reticulación.
Detectar posibles fragmentos o subproductos de degradación.
3. Grado de reticulación y análisis de peso molecular
(1) Determinación del grado de reticulación
Método TNBS (ácido sulfónico de trinitrobenceno): cuantificar los grupos amino libres no reaccionados y calcular indirectamente el grado de reticulación.
Análisis elemental: evaluar la cantidad de aminoácido introducido por el cambio en el contenido de nitrógeno.
(2) Distribución del peso molecular
Cromatografía de permeación en gel (GPC / SEC):
Utilice la dispersión de luz multiángulo (MALS) para detectar el peso molecular absoluto.
Comparar los cambios en el peso molecular y la distribución antes y después de la reticulación.
4. Caracterización térmica y morfológica
(1) Calorimetría de escaneo diferencial (DSC)
Detectar el cambio en la temperatura de transición vítrea (Tg) después de la reticulación, lo que refleja la restricción del movimiento de la cadena molecular.
(2) El análisis termogravimétrico (TGA) evalúa la estabilidad térmica. La reticulación suele aumentar la temperatura de descomposición.
(3) Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Observe la morfología microscópica después de la reticulación (como la estructura porosa o la red densa).
5. Verificación biológica y funcional
(1) Estabilidad enzimática
Tratar con la hialuronidasa y comparar la tasa de degradación antes y después de la reticulación.
(2) Propiedades de hinchazón
Determine la tasa de hinchamiento de equilibrio del hidrogel reticulado para reflejar la densidad de la red de reticulación.
6. Otras técnicas auxiliares
Difracción de rayos X (DRX): Analiza el cambio en la cristalinidad (la reticulación a menudo conduce a la amorfización).
Espectroscopia Raman: Confirmación complementaria de información de enlaces químicos.
Etiquetado fluorescente (si el aminoácido contiene grupos aromáticos): siga el sitio de reticulación a través de espectroscopia de fluorescencia.
Notas
1. Experimento de control: el hialuronato de sodio no reticulado y los aminoácidos libres deben configurarse como controles.
2. Optimización de la condición: Las condiciones de reacción de reticulación (pH, temperatura, tiempo) pueden afectar la estructura y deben anotarse en el informe.
3. Asociación de datos: combinar los resultados de varios métodos y validar la estructura de enlace cruzado.
A través del análisis multidimensional anterior, se puede confirmar completamente la estructura química, el sitio de reticulación y las propiedades materiales del hialuronato de sodio reticulado de aminoácidos.
