Lu Fan, Ole Jung, Markus Herrmann, Marina Shirokikh, Sanja Stojanovic, Stevo Najman, Fabian Körte, Xin Xiong, Katja Schenke-Layland,* y Mike Barbeck

El reticulamiento de colágeno mediante rayos ultravioleta A y riboflavina (UVA/R) ha surgido como una técnica clave en terapias clínicas, especialmente en oftalmología, desde la década de 1990. A pesar de su adopción clínica, la falta de claridad del mecanismo detallado y la necesidad de un proceso de fabricación refinado requieren una investigación más profunda. Este estudio avanza en la comprensión del colágeno cruzado UVA/R, centrándose en identificar los principales sitios de reticulación mediante siete péptidos sintéticos y en explorar las vías de la riboflavina. Mediada por la reticulación.

Los resultados demuestran que los residuos de tirosina son sitios clave de reticulación, y la riboflavina desempeña un doble papel como catalizador e inhibidor competitivo en el proceso de reticulación. Además, la matriz de colágeno reticulada UVA/R exhibe un equilibrio más armonioso entre estabilidad y degradabilidad en comparación con matrices de colágeno químicamente reticuladas, junto con propiedades mecánicas superiores y una biocompatibilidad aumentada. Experimentos in vivo adicionales.

1. Introducción

Los colágenos se han utilizado ampliamente en diversos campos biomedi-caules como biomateriales funcionales, incluyendo cicatrización de heridas, injertos óseos y regeneración, oftalmología, ingeniería cardiovascular e de tejidos neurales.     Para optimizar la función de los colágenos, principalmente el colágeno tipo I (colágeno), en estas aplicaciones, la reticulación suele ser imprescindible, mejorando sus propiedades mecánicas, bioestabilidad, biocompatibilidad y otras funcionalidades. Entre las diversas tecnologías de reticulación, la reticulación de rayos ultravioleta A y riboflavina (UVA/R) destaca como una técnica particularmente prometedora, ya que ha sido aprobada para su uso clínico en terapia oftalmológica desde principios de los años 90.   Esta comodidad y seguridad inherentes tienen un enorme potencial para ampliar el panorama de aplicaciones de colagenos en diversos campos biomédicos.

El ámbito de la fotocruzación UVA avanza rápidamente, revelando aplicaciones prometedoras en todas las disciplinas médicas. Su utilidad ahora se extiende a la creación de hidrogeles innovadores destinados a minimizar las adherencias postoperativas, lo que tiene el potencial de revitalizar la recuperación de la cirugía laparoscópica. Además, la córnea porcina acelular cruzada UVA/R se está evaluando como un posible andamiaje para la tesis de Boston Keratopros, reflejando avances significativos en biocompatibilidad y eficiencia. La aplicación de esta técnica se ha diversificado, con métodos revolucionarios como la preparación sin glutaraldehído para implantes cardíacos, ingeniería de tejido menisco, dispositivo controlado de administración de fármacos, y extiende su influencia a dominios de investigación punteros como la bioimpresión 3D y sistemas organ-on-a-chip, mostrando el potencial dinámico de la entrecruzamiento UVA/R en la ingeniería biomédica moderna.

A pesar de estas aplicaciones prometedoras, el mecanismo que desacelera la reticulación UVA/R sigue siendo un área de investigación y debate continuos. Muchos estudios sugieren que la riboflavina funciona principalmente como un fotocatalizador que genera especies reactivas de oxígeno (ROS) para inducir la oxidación y polimerización del colágeno. Teorías alternativas proponen que este es un proceso fotoquímico mucho más complejo, que depende de la exposición al oxígeno y/o a los rayos UVA. También existen debates sobre los sitios de reticulación específicos en las moléculas de colágeno, algunos afirman que no son selectivos, mientras que otros señalan aminoácidos como la sinuso, histidina, arginina, tirosina o metionina.   

 Estas opiniones divergentes sobre los mecanismos de reticulación UVA/R subrayan una falta de comprensión integral, presentando desafíos en la estandarización de procesos de fabricación y en la evaluación regulatoria de dispositivos médicos. Para abordar estas brechas de conocimiento y potencialmente aumentar las aplicaciones con colágeno, nuestro estudio investiga los principios fundamentales de la reticulación UVA/R.

Al explorar explicaciones mecanicistas alternativas y desentrañar las complejas interacciones entre el colágeno y el ri-boflavina, proporcionamos valiosas ideas que contribuirán al perfeccionamiento y optimización de las técnicas de entrecruzamiento UVA/R.   Sin embargo, investigar el mecanismo de reticulación en el colágeno presenta desafíos significativos debido a los procesos fotoquímicos dinámicos y a la complejidad molecular del colágeno. Para desentrañar estos mecanismos detallados, se requieren tecnologías experimentales avanzadas y métodos analíticos exhaustivos que identifiquen y caracterizen con precisión los intermedios y caminos transitorios. Además, la variabilidad en las propiedades físicas y químicas del colágeno, influenciada por la fuente, tipo, procesamiento y factores ambientales del colágeno, añade capas de dificultad a estos estudios, lo que requiere un enfoque matizado para comprender plenamente el proceso de entrecruzamiento.

En nuestro estudio, adoptamos un marco experimental innovador, sintetizando siete péptidos sintéticos que representan sitios de reticulación con potencial crucial sobre colágeno, centrados en residuos de aminoácidos como tirosina (Y), lisina (K), arginina (R), me-tionina (M), histidina (H), triptófano (W) y fenilalanina (F). Estos aminoácidos fueron seleccionados por sus grupos reactivos y posiciones en la región no helicoidal de la molécula de colágeno, que es más accesible para reacciones de entrecruzamiento y crucial para potenciar las propiedades mecánicas.  (Figura 1) Exponiendo estos péptidos y colágeno nativo a diferentes proporciones de energía UVA y riboflavina, diseccionamos el proceso de reticulación mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). También comparamos el entrecruzamiento UVA/R con los entrecruzados químicos, utilizando microespectroscopía Raman para discernir alteraciones moleculares distintas tras el entrecruzamiento. Evaluamos la resistencia mecánica, la estabilidad térmica, la resistencia a la degradación y la citotoxicidad, culminando en ensayos de implantación in vivo para evaluar la biocompatibilidad y el potencial de regeneración tisular.

Al analizar el proceso de reticulación a nivel molecular, nuestro estudio revela conocimientos clave sobre los roles e interacciones de aminoácidos específicos, arrojando luz sobre la dinámica intrincada de la reticulación UVA/R. Estos descubrimientos tienen importantes implicaciones para el avance de la ciencia de biomateriales, sirviendo de base para desarrollar biomateriales avanzados, biocompatibles y mecánicamente robustos, allanando así el camino para aplicaciones biomédicas más eficaces y seguras.

Figura 1.  Esquema del entrecruzamiento de colágeno UVA/riboflavina. UVA: Ultravioleta Luz A, la fuente de la fotoactivación. R: riboflavina, estado fundamental. R*: estado excitado de riboflavina tras la exposición inicial a UVA. 3 R*: Estado triplete ri- boflavina tras el cruce intersistémico, un estado de mayor energía capaz de participar en reacciones de reticulación. O2: oxígeno molecular. 1 O2: oxígeno singlete, una especie reactiva de oxígeno generada por transferencia de energía de riboflavina fotoactivada a oxígeno molecular. HO2•: radical hidroperoxilo. RH: estructura general que representa a un donante de hidrógeno.  Rox: forma oxidada del donante de hidro-drogen tras transferencia de hidrógeno. Aminoácidos: Y (tirosina), K (lisina), R (arginina), M (metionina), H (histidina), W (triptófano, no presente en el colágeno porcino tipo I), F (fenilalanina).

2. Resultados y discusión

2.1. Preparación y caracterización de la matriz de colágeno

El colágeno tipo I, procedente de piel porcina debido a su gran parecido con el tejido humano, es un marco sólido para la ingeniería tisular. Esta forma de colágeno es ideal para aplicaciones biomédicas debido a su abundancia en la piel y a su estructura triple helicoidal bien definida, compuesta por dos cadenas α1 y una cadena α2 (Figura2A). SDS-PAGE indicó la integridad y pureza de nuestro colágeno de origen porcino tras una serie de procesiones de homogeneización mechanicas, utilizando colágeno de cola de rata como control.

La Figura 2B muestra bandas distintas en el gel SDS-PAGE tanto para colágeno de origen de piel porcina (P-col) como para colágeno derivado de cola de rata (R-col), destacando las bandas α 1 y α2 a ≈150 y 140 kDa, respectivamente. No se observaron más bandas por debajo de los 100 kDa. También se distinguían bandas de mayor peso molecular, correspondientes a dímeros (β) y trímeros (y), lo que indica la alta pureza de la matriz de colágeno y la integridad mantenida tras el procesamiento mecánico. La espectroscopía de dicroísmo circular (CD) proporcionó una confirmación adicional, mostrando picos característicos negativos y positivos que indican la presencia de la bien mantenida conformación triple helicoidal del colágeno (Figura2C). Una alta pureza e integridad estructural son cruciales para la interacción efectiva con agentes de reticulación y un análisis preciso de propiedades mecánicas.

Se empleó microscopía electrónica de barrido (MEV) para evaluar los cambios morfológicos en las matrices de colágeno antes y después de la reticulación UVA/R.  (Figura 2D) Inicialmente, el colágeno no entrecruzado mostraba una textura superficial única similar a un cristal en su estado hidratado-congelado, desviándose de la estructura fibrilar convencional debido a la homogeneización y los procesos de agitación/espuma implementados durante su preparación (Figura 2Da). Esta interrupción intencionada era necesaria para el diseño posterior de la matriz. Tras la reticulación, se observó una transformación notable en la matriz de colágeno reticulado UVA/R. Presentaba una arquitectura intrincada y porosa con vacíos y poros interconectados, que iban de 1 a 20 μm de tamaño, lo que contribuía a su complejidad tridimensional. (Figura 2Db) La heterogeneidad en el tamaño de los poros puede favorecer un entorno más natural y dinámico para las células, permitiendo una adherencia celular, migración y diusión de nutrientes variadas, cruciales para la regeneración y reparación de tejidos. Además, las fibras de colágeno reestructuradas pueden potenciar señales mecánicas que guían la alineación y la dierenciación celular, contribuyendo así a la formación de una estructura tisular más funcional y organizada en aplicaciones biomédicas.

Además, la densificación y el aumento de la densidad resultantes de la liofilización sugieren una mayor resistencia a la deformación mecánica, una característica esencial para biomateriales expuestos a tensiones fisiológicas (Figura 2Dc,d). Esta robustez mecánica mejorada no solo garantiza la integridad estructural de la matriz de colágeno bajo diversas condiciones físicas, sino que también puede extender su vida útil, haciéndola más adecuada para aplicaciones biomédicas a largo plazo como dispositivos implantables o células de tejido antiguo.

Figura 2.  Caracterización estructural y mecánica del colágeno antes y después del tratamiento UVA/riboflavina. A) Modelo molecular de la estructura de triple hélice tipo I de collage, el bloque fundamental de las matrices de colágeno. B) ANÁLISIS SDS-PAGE que muestra la caracterización del colágeno tipo I extraído de la cola de rata (R-col) y la piel de cerdo (P-col). C) Espectros de dicroísmo circular (CD) de R-col y P-col, con elipticidad que indica la preservación de la estructura secundaria de la cologen. D) Imágenes de microscopía electrónica de barrido que presentan el examen morfológico del colágeno no entrecruzado y del colágeno cruzado UVA/R en su estado hidratado-congelado (a,b), así como en su estado liofilizado (c,d).

2.2. Exploración del mecanismo de reticulación UVA/R

Tras establecer los aspectos fundamentales de la preparación de la matriz de colágeno y analizar sus características iniciales, nos adentramos en la exploración del mecanismo de la reticulación UVA/R, un proceso fundamental que altera y potencia significativamente las propiedades de la matriz. Esta sección investiga dónde se forman los enlaces cruzados en la molécula de colágeno, el papel de la riboflavina como catalizador o participante, y además postula la necesidad de ajustar la reticulación cruzada UVA/R del colágeno en las diversas aplicaciones.

2.2.1. ¿Dónde se forman los enlaces cruzados en la molécula de colágeno?

En nuestro estudio, investigamos el mecanismo de reticulación del colágeno tipo I a nivel molecular, centrándonos en regiones no helicoidales que mejoran las propiedades mecánicas tras la reticulación. Empleando siete péptidos sintéticos que representan aminoácidos cruciales — tirosina (Y), lisina (K), arginina (R), metionina (M), histidina (H), triptófano (W) y fenilalanina (F) — nuestro objetivo era identificar sitios específicos de reticulación. Estos aminoácidos fueron seleccionados por sus funciones reactivas distintivas y posiciones estratégicas dentro del colágeno de la molécula (Figura S1, Apoyo a la formación). Específicamente, la tirosina (Y) posee un grupo fenol reactivo capaz de participar en enlaces covalentes. La lisina (K) y la arginina (R) están equipadas con grupos aminos que son candidados para la formación de enlaces químicos.

La histidina (H) es caracteritizada por un anillo imidazol y la fenilalanina (F) por un anillo aromático, ambos que generan posibles sitios de reactividad. Nuestros análisis de LC-MS delinearon un patrón distinto: las modificaciones posteriores al tratamiento con UVA/R ocurrieron exclusivamente en pep-tiredes portadores de tirosina, probablemente debido a la generación de edades de enlace covalente de ditirosina (Figura 3A,B). Esta especificidad se acentuó aún más por la ausencia de productos de enlace covalente en los otros seis aminoácidos, incluidos los péptidos, lo que subraya el papel preferente de la tirosina en el mecanismo de reticulación (Figuras S2 y S3, Información de respaldo). La propensión a la formación de ditirosina, inicialmente planteada a partir de nuestros estudios de péptidos sintéticos, fue corroborada de forma constructiva por el análisis LC-MS de hidrolizados de colágeno reticulado UVA/R (Figura 3C,D).

Durante la nación de examen del colágeno cruzado UVA/R, la ditirosina fue identificada de forma fiable mediante el uso del modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM) en espectrometría de masas y autenticada mediante comparaciones con un estándar de ditirosina. Cabe destacar que nuestro análisis de LC-MS sobre hidrolizados de colágeno reveló un pico muy similar, aunque indistinguible del estándar de ditirosina. Reconociendo la probabilidad de variaciones isoméricas o espaciales dentro de las moléculas de colágeno, inferimos cautelosamente, basándonos en consideraciones de masa, que los picos coincidentes podrían representar formas de ditirosina (Figura S4, Información de apoyo). Dado el resultado proteico del colágeno porcino tipo I (números de acceso A0A1S7J210 para COL1A1 y A0A1S7J1Y9 para COL1A2), la molécula completa de colágeno de la ma- tura debería mostrar un peso molecular de 282,85 kDa, abarcando 3152 residuos de aminoácidos, incluyendo 13 residuos de tirosina.

Si asumimos que todos estos residuos de tirosina son igualmente reactivos y disponibles para la reticulación, nuestra LC-MS indica que una estimación conservadora de tirosina reticulada dentro de la matriz de colágeno es al menos del 14,3% (Figura S5, Información de Apoyo). Esta deducción es fundamental para evaluar el grado de reticulación de colágeno reflejada por las condiciones UVA/R y enriquece nuestra comprensión de sus mecanismos.

La demostración de la ditirosina en el colágeno reticulado UVA/R hidrolizado es una afirmación fundamental de la exclusión de la tirosina en el esquema de reticulación. Esta evidencia no solo refleja los resultados experimentales de péptidos sintéticos, sino que también ejemplifica la relevancia práctica de la entrecruzamiento de tirosina en matrices de colágeno. La presencia de ditirosina es una característica molecular de un entrecruzamiento exitoso, ofreciendo una visión fundamental que se prevé sea crucial para perfeccionar las tecnologías de reticulación UVA/R en colágeno adaptadas a usos biomédicos.

2.2.2. Riboflavina: ¿Catalizador de Reticulación o Participante?

Al explorar el papel de la riboflavina en la entrecruzamiento del colágeno, nuestro estudio revela su doble función como catalizador y como participante.  Al examinar la relación entre las proporciones tirosina y riboflavina tanto en el sistema peptídico como en el colágeno, observamos tendencias notables similares: una correlación positiva entre la ecacia entrecruzada y la riboflavina en proporciones más bajas, que se invierte en concentraciones más altas (Figura 3E). Por ejemplo, en el colágeno, a concentraciones más bajas de riboflavina (proporciones tirosina/riboflavina de 1/0,0625 a 1/0,25), hubo un aumento significativo en el módulo de edad de la memoria en relación con el colágeno no reticulado. Sin embargo, a concentraciones más altas, el módulo de almacenamiento se desclinó bruscamente (Figura 3F).

La notable reducción en la resistencia mecánica de las matrices de col-lagen a concentraciones elevadas de riboflavina motivó la exploración de los mecanismos subyacentes.  Nuestra investigación se guió por un modelo cinético teórico, que indica una dependencia crítica de las dos vías de la reticulación de fos-tocruz mediada por riboflavina sobre los niveles de oxígeno ambiental. Este modelo inspiró nuestro descubrimiento: la eficiencia de la reticulación es marcadamente sensible a la concentración de riboflavina, especialmente en entornos con disponibilidad constante de osígeno.

Este matizado comportamiento fotoquímico de la riboflavina sugiere dos vías de reacción principales tras la excitación UVA, como se ilustra en la Figura 1. Inicialmente, la riboflavina actúa como fotocatalizador, generando ROS que facilitan la reticulación intermolecular, predominantemente en los residuos de tirosina situados en las regiones no helicoidales del colágeno. Este proceso potencia las propiedades mecanicas de la matriz. Sin embargo, una vía alternativa se vuelve predominante a concentraciones más altas de riboflavina, donde la riboflavina participa activamente en la reacción de reticulación, agotando la ROS y, posteriormente, disminuyendo la eficiencia de la reticulación. Además, los procesos de transferencia de electrones pueden inducir interacciones entre residuos de aminoácidos cargados positivamente como la lisina, la histidina y la arginina, y la riboflavina cargada negativamente, lo que puede influir en las propiedades mecánicas de la matriz de colágeno. Este aspecto merece una validación experimental adicional.

Además, la exposición a UVA para reticular el ma-trix de colágeno también se optimizó en nuestro estudio. Nuestros hallazgos, ilustrados en la Figura 3E , indican que la exposición óptima a UVA para la reticulación de matriz de cola-gen fue de 10800 mJ cm_2. Más allá de esta dosis UVA, el módulo de almacenamiento de las matrices de colágeno disminuyó notablemente, lo que sugiere una posible degradación del pliegue de colágeno debido a la sobreexposición. Curiosamente, para la reticulación de péptidos, la dosis óptima de UVA fue notablemente menor, con 600 mJ cm_2 (Figura S6, Información de apoyo); y en otro trabajo, Ue-mura et al. identificaron que la exposición óptima a UVA para el entrecruzamiento de colágeno dentinal humano era de 1600 mJ cm_2.

En conjunto, estos conocimientos revelan una capa adicional del mecanismo de reticulación UVA/R, lo que pone de manifiesto la necesidad crucial de ajustar la concentración de riboflavina y la exposición a los UVA para aplicaciones prácticas. La notable disparidad entre los ambientes tisulares in vivo y los sistemas de reticulación de colágeno in vitro es sustancial. Variaciones en las fuentes de colágeno (contenido de residuos de tirosina), concentración, densidad y diferentes condiciones de tampón requieren enfoques adaptados para ajustar la concentración de riboflavina y la exposición a UVA para lograr resultados óptimos en la reticulación.

Figura 3.  Diseccionando el mecanismo de reticulación UVA/R en el colágeno. A) Cromatografías de LC-MS tras el tratamiento UVA/R del péptido Ac-AGGY-NH2 con muestras de control de Ac-AGGY-NH2 y riboflavina.  B) Espectros de masas correlacionados con picos recién emergidos (a–d) en cromatogramas de Ac-AGGY-NH2 tratados con UVA/R. C) Cromatografías LC-MS de di-tirosina estándar e hidrolizados de colágeno no reticulado y colágeno cruzado UVA/R, D) con espectros de masas correspondientes. E) Módulo de almacenamiento (G') del colágeno en función de la exposición a UVA (mJ cm_2 ), lo que muestra el aumento dependiente de la dosis en las propiedades mecánicas. F) Módulo de almacenamiento (G') en relación con la proporción de Tyr (en colágeno)/riboflavina, ilustrando el impacto de las diferentes concentraciones de riboflavina en la resistencia mecánica de las matrices de colágeno.

2.3. Investigación comparativa del impacto de UVA/R y la reticulación química en matrices de colágeno

Tras la elucidación de la complejidad del mecanismo de reticulación UVA/R, centramos nuestra atención en la investigación comparativa destinada a evaluar de forma exhaustiva los efectos de diferentes técnicas químicas de entrecruzamiento en matrices de colágeno. Cada análisis contribuye a una comprensión holística de las alteraciones estructurales y funcionales inducidas por UVA/R y otros métodos químicos de reticulación.

2.3. 1. Microespectroscopía Raman

La microespectroscopía Raman ha ofrecido una profunda visión sobre la integridad molecular de matrices de colágeno sometidas a diferentes técnicas de entrecruzamiento. Las asignaciones detalladas de picos junto con sus correspondientes referencias se recopilan en la Tabla S3 (Información de Apoyo). En nuestro estudio, el colágeno cruzado Col UVA/R (Xcol_UVA/R) y el colágeno entrecruzado EDC/NHS (Xcol_EDC/NHS) mantuvieron sus estructuras secundarias esenciales tras la reticulación en comparación con el colágeno no entrecruzado (Col), como lo demuestran las bandas amida consistentes en todas las muestras: Amida III (1260 cm_1), Amida II (1452 cm_1) y Amida I (1664 cm_1) (Figura4A).

Los espectros revelaron que, aunque se mantuvo la característica estructura de triple hélice del colágeno, hubo reducciones notables en la intensidad de los picos (815, 936, 971 y 1080 cm_1) asociados a las vibraciones de cadena lateral de aminoácidos implicadas tanto en las reacciones UVA/R como en las reacciones de reticulación EDC/NHS. Estos hallazgos sugieren reestructuraciones moleculares sutiles pero definitivas dentro de la arquitectura del colágeno, especialmente modos vibracionales de acierto, como el estiramiento C-C, el movimiento de estiramiento C-C y el balanceo de CH3 dentro de los residuos de lisina, hidroxilisina y tirosina, que son cruciales para el proceso de reticulación.

Cabe destacar que el grado de reducción de intensidad fue más pronunciado en la generación de colación entrecruzada EDC/NHS, lo que indica una mayor abundancia de encrucillados mediados por oflysina e hidroxilisina en comparación con los entrecruzados mediados por tirosina en el cruzamiento UVA/R. Un cambio intrigante de 936 a 927 cm_1 tras el entrecruzamiento EDC/NHS posiblemente alude a una tensión aumentada derivada del empaquetado de residuos de prolina tras el entrecruzamiento.

Un escrutinio adicional mediante análisis multivariante de componentes principales (PCA) corroboró estas sutilezas estructurales, discriminando entre las muestras no tratadas y las entreticuladas (Figura 4B–D). La agrupación distinta de puntuaciones de PC-3 y PC-4 elucidó los fundamentos moleculares únicos de cada tratamiento, con la reticulación UVA/R manifestando una huella molecular distinta en comparación con su contraparte química. Las puntuaciones PC-3 de resultados positivos eran evidentes para espectros Xcol_UVA/R y negativos para Col y Xcol_EDC/NHS. Esta tendencia se reflejó en el gráfico de carga del PC-3, que presentaba picos destacados en 936 cm_1 (prolina) y 1688 cm_1 (Amida I).

Al mismo tiempo, las puntuaciones PC-4 revelaron rangos positivos tanto para Xcol_UVA/R como para Xcol_EDC/NHS, mientras que los espectros de Col se agruparon en el rango negativo. Las cargas correspondientes en PC-4 trazan picos asociados a la reticulación en 896, 980, 1099, 1309, 1439 y 1655 cm_1, lo que indica los modos vibracionales de 0 (C-C), 0 (C-N), así como la deformación de torsión, flexión o movimiento de CH3 /CH2, entre otros, reforzando las distinciones moleculares observadas por la reticulación.

La microespectroscopía Raman proporcionó patrones de huella molecular que dilucidan los cambios que ocurren a nivel molecular en el colágeno tras la entrecruzamiento, así como las diferentes características entre el colágeno entrecruzado mediante los métodos UVA/R y EDC/NHS. Estos hallazgos espectroscópicos son fundamentales para guiar la funcionalización del colágeno en aplicaciones biomédicas avanzadas.

2.3.2. Cromatografía por exclusión de tamaño de la matriz de colágeno digerida

La cromatografía de exclusión por tamaño (CE) de muestras digeridas en colagénasa reveló diferencias notables en el perfil molecular de matrices de colágeno tras la reticulación (Figura 4E–G). Dado que la colagenasa divide principalmente los enlaces peptídicos dentro de las moléculas de colágeno en los característicos tripletes Gly-X-Y, donde X e Y suelen ser residuos de prolina o hidroxiprolina, el proceso enzimático de digestión produce fragmentos peptídicos más pequeños. La presencia de fragmentos peptídicos más grandes en muestras reticuladas, especialmente notables en la región del pico 1, indica la eficacia de la reticulación en la obstrucción de la clivagancia enzimática. Este hallazgo fue especialmente pronunciado en el conjunto cruzado UVA/R, donde las entidades peptídicas considerables se mantuvieron en cierta medida.

Figura 4.  Caracterización integral de matrices de colágeno cruzado no reticulado (Col), colágeno cruzado UVA/R (Xcol_UVA/R), colágeno entrereticulado EDC/NHS (Xcol_EDC/NHS) y matrices de colágeno cruzado genipina (Xcol_Genipin). A–D) Análisis microespectroscópico Raman: (A) Espectros Raman promedio que resaltan picos y patrones distintos. Cada condición se replicó al menos tres veces (n ≥ 3), adquiriendo múltiples espectros para cada réplica (n ≥ 25). Los resultados del análisis de datos multivariantes incluyen resultados del análisis de componentes principales (PCA) que incluyen cargas espectrales de PCA de PC-3 y PC-4 (C), la gráfica de puntuaciones de PC-4 frente a PC-3 (B) y la representación estadística de puntuaciones de PC-3 y PC-4 como valores medios ± SD (D). Las elipses de confianza en (B) significan intervalos de confianza del 95%. E–G) Cromatografía por tamaño y excluión: trazas que muestran el comportamiento de matrices de colágeno, detectadas mediante un detector UV. Las vistas en primer plano de la Cumbre 1 y la Cumbre 2 se detallan en (F) y (G). Módulo de almacenamiento dinámico H (G') e I) módulo de pérdida (G'') extraído de la región LVE de la meseta durante barridos de frecuencia.

similar a las muestras químicamente reticuladas. Esta observación pone de manifiesto la eficacia comparable de la interconexión UVA/R con métodos químicos tradicionales como EDC/NHS y genípina para proteger matrices de colágeno frente a la digestión enzimática. Además, la reticulación UVA/R demostró un perfil ventajoso con menos subproductos pequeños en comparación con la reticulación química.

Los cromatogramas para las muestras EDC/NHS y tratadas con genipina mostraron picos adicionales, lo que sugiere la presencia de subproductos, que podrían conducir a ectoectos citotóxicos o provocar respuestas inmunitarias cuando se usan en aplicaciones biomédicas. En cambio, el proceso de reticulación UVA/R parece haber dado lugar a un perfil más limpio con menos fragmentación, lo que puede traducirse en un perfil de seguridad más favorable para aplicaciones in vivo. La integridad molecular que mantiene el entrecruzamiento UVA/R, junto con su reducido perfil de subproducto, la posiciona como un método potente para preparar biomateriales basados en colágeno para la medicina regenerativa.

2.3.3. Propiedades reológicas

Las propiedades reológicas de las matrices de colágeno entrecruzadas, analizadas mediante barridos dinámicos de amplitud y frecuencia de esfuerzo cortante, proporcionaron información sobre las implicaciones mecánicas de cada estrategia de reticulación a temperaturas fisiológicas. (Figura 4H,I) Xcol_UVA/R demostraron un perfil elástico mejorado, como lo demuestra su módulo de almacenamiento, sin una pérdida corre-spondente en la resiliencia del material. Este equilibrio entre elasticidad y durabilidad subraya el potencial del entrecruzamiento UVA/R para reforzar la integridad mecánica de los andamios de colágeno sin sacrificar la capacidad del material para absorber y disipar energía, característica esencial para biomateriales que deben soportar entornos fisiológicos dinámicos.

Por otro lado, Xcol_EDC/NHS presentó un modus lus de almacenamiento inesperadamente menor (Figura 4I), lo que sugiere que, aunque el entrecruzamiento químico con EDC/NHS modifica el material, puede que no mejore uniformemente las propiedades elásticas de la matriz de colágeno. Este hallazgo podría tener implicaciones para la aplicación de materiales entrecruzados EDC/NHS en escenarios donde la resistencia mecánica es un requisito previo. En cambio, Xcol_Genipin mostró un marcado aumento de la densidad, indicado por su mayor módulo de almacenamiento. Sin embargo, el aumento de rigidez puede imponer limitaciones a la compatibilidad funcional del material, especialmente en lo que respecta a las actividades cel-lulares. Los materiales que son excesivamente STI podrían dificultar potencialmente la migración y proliferación celular, ambos fundamentales para la regeneración e integración de tejidos.

En conjunto, estos resultados sugieren que la entrecruzamiento UVA/R logra un equilibrio óptimo entre rigidez y flexibilidad, lo que puede favorecer funciones celulares, presentando así una vía prometedora para el desarrollo futuro de escandos basados en colágeno para la medicina regenerativa.

2.3.4. Estabilidad térmica

Las mediciones de calorimetría de barrido diernencial (DSC), representadas en la Figura 5A,B, proporcionaron información esencial sobre la estabilidad terapéutica de las matrices de colágeno. La temperatura de desnaturalización (Tm), observada como un pico en las curvas DSC, marca el punto de transición donde la triple hélice de colágeno comienza a desenrollarse debido a la ruptura de enlaces de hidrógeno estabilizadores. Este evento térmico va acompañado de la absorción de calor, que se mide cuantitativamente como el cambio en la entalpía (ΔH).

En nuestro estudio, se registró una elevación notable de la TM en las muestras de colágeno reticulado. Específicamente, Xcol_UVA/R y Xcol_EDC/NHS muestran valores de TM en 75 y 76,0 °C respectivamente, lo que indica una estabilidad térmica mejorada que potencialmente favorece mantener la integridad estructural a temperaturas fisiológicas. Xcol_Genipin, aunque muestra una Tm más baja a 60,1 °C, sigue mostrando una resistencia térmica aumentada en comparación con el colágeno no reticulado. Los cambios en talpía (ΔH) asociados al proceso de desnaturalización, como se muestra en la Figura 5B, respaldan aún más estos hallazgos, con Xcol_UVA/R y Xcol_EDC/NHS demostrando una absorción sustancial de calor, reflejando la energía necesaria para alterar la estructura reforzada del colágeno debido a la entrecruzamiento. Estas características termodinámicas implican que la reticulación proporciona estabilidad adicional a las matrices de colágeno, lo cual es crucial para su rendimiento bajo estrés térmico in vivo.

2.3.5. Resistencia a la degradación

Nuestro estudio se extendió a un análisis comparativo de degradación de matrices de colágeno entrecruzadas en condiciones fisiológicamente relevantes utilizando suero salino tamponado con fosfato (PBS) y so-luciones de colagenosa (Figura 5C,D). El perfil de degradación de Xcol_UVA/R fue especialmente convincente, mostrando una resistencia comparable a la de matrices químicamente reticuladas, lo que supone una mejora significativa respecto al colágeno no entrecruzado. Esta observación es fundamental, ya que es la primera en comparar directamente la resistencia a la degradación del colágeno cruzado UVA/R con variantes químicamente reticuladas. Xcol_EDC/NHS mostró una durabilidad excepcional en PBS, manteniendo más del 60% de su masa tras 30 días, lo que indica su potencial para aplicaciones donde la estabilidad prolongada es fundamental. El colágeno reticulado entre genipina y cruz también mostró una resistencia notable en las soluciones de colagenasa, lo que sugiere su idoneidad para entornos con degradación enzimática activa.

Sin embargo, la robustez de estas matrices químicamente reticuladas plantea preocupaciones en el contexto de la ingeniería de tejidos, donde la cinética de degradación de andamios debe sincronizarse con la regeneración tisular. [75] Biomateriales que se degradan demasiado lentamente pueden interrumpir el delicado proceso de formación de nuevo tejido, lo que podría interferir con la migración celular, la vascularización y el proceso natural de remodelación del tis-sue. [30] Además, la presencia persistente de materiales no degradados puede provocar una respuesta inflamatoria sostenida, lo que puede afectar negativamente a los resultados de la cicatrización. [31] En la ingeniería tis-sue, el biomaterial ideal debe proporcionar apoyo me-mecánico inicial pero ceder gradualmente su lugar a la nueva formación de tis-sue. Por lo tanto, optimizar la tasa de degradación para asegurar una transición sin costuras del andamiaje al tejido nativo es fundamental. Nuestros hallazgos ponen de manifiesto la necesidad de un enfoque matizado en el diseño de andamios basados en colágeno, que busque un equilibrio delicado que favorezca la reparación inicial del tejido y permita posteriormente la integración natu-ral sin provocar inflamación crónica u otras respuestas negativas.

2.3.6. Prueba de citotoxicidad in vitro

La biocompatibilidad de nuestras matrices de colágeno fue evaluada mediante el ensayo CCK-8 utilizando fibroblastos L929, siguiendo las directrices DIN EN ISO 10993–5: 2009 y DIN EN 10993-12: 2021. La norma sostiene que los biomateriales no deben reducir la viabilidad celular por debajo del 70% del control para considerarse biocompatibles. Como se muestra en la Figura 5E, las matrices de colágeno reticuladas, especialmente Xcol_EDC/NHS, mostraron una viabilidad celular reducida, lo que sugiere posible citotoxicidad por agentes o subproductos residuales de reticulación. En contraste, Xcol_UVA/R superó el umbral de biocompatibilidad con una viabilidad superior al 80%, lo que indica su idoneidad para aplicaciones de ingeniería tisular debido a su favorable equilibrio entre estabilidad y degradación.

Figura 5.  Caracterización de matrices de colágeno y evaluación biológica in vitro. A) Curvas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) que ilustran las transiciones térmicas de matrices de colágeno, marcadas con temperaturas máximas (Tm). B) Cambios en la entalpía (ΔH) durante la desnaturalización de matrices de colágeno. Pérdida de masa durante la degradación in vitro en solución de solución de suero salino tamponado con fosfato (PBS) y solución de D) colagenasa. E) Prueba de citotoxicidad in vitro utilizando fibroblastos L929 mediante ensayo CCK-8, siguiendo la norma ISO 10993–5. F) Imágenes representativas de microscopía láser confocal (CLSM) de tinción viva y muerta (Calcein-PI) de células de L929 cultivadas en andamios de colágeno a 1, 4 y 7 días después de la siembra. G) Análisis cuantitativo de la proporción de células vivas/muertas, derivado de las imágenes CLSM, utilizando el software ImageJ para la cuantificación celular. H) Cuantificación de células vivas, destacando la viabilidad y proliferación celular a lo largo del periodo del estudio. La evaluación estadística para las partes (G) y (H) se realizó utilizando ANOVA para comparaciones múltiples en diferentes momentos de tiempo, con comparaciones específicas entre el grupo Xcol_UVA/R y otros grupos. (Las barras de escala en las imágenes de teñido de muertos vivos corresponden a 100 μm. Calcein en verde, PI en rojo).

La tinción de vivo-muerto (Figura 5F) con su posterior análisis cuantitativo (Figura 5G,H) puso de manifiesto aún más la mejor performance de Xcol_UVA/R, que apoyó la supervivencia y proliferación celular. Inicialmente, en el primer día, las proporciones vivas/muertos para los grupos Col y Xcol_UVA/R eran comparables, lo que corroboraba los resultados de la prueba de citotoxicidad de extracción mostrada en la Figura 5E. Sin embargo, a medida que el cultivo avanzaba hacia los días 4 y 7, el andamiaje Xcol_UVA/R demostró su superioridad con una viabilidad y proliferación celular significativamente mejoradas, probablemente atribuible a sus atributos biomecánicos. Mientras que el andamiaje de colágeno no entrecruzado, a pesar de ser biocompatible, no mostró la integridad estructural necesaria para interacciones óptimas entre células y materiales, como lo demuestra su rendimiento a los 4 y 7 días. En contraste, las matrices de colágeno entrecruzadas con EDC/NHS y genipina mostraron proporciones disminuidas de células vivas durante toda la duración del estudio, lo que podría generar preocupaciones sobre sus perfiles de citotoxicidad.

Nuestros análisis exhaustivos, que abarcan perfiles enzimáticos de excavación, resistencia mecánica, estabilidad térmica y resistencia a la degradación, cuando se yuxtaponen con evaluaciones in vitro de citotoxicidad, revelan una evaluación multifacética de matrices de colágeno entrecruzadas para aplicaciones biomédicas. Xcol_UVA/R destaca por su perfil equilibrado; Exhibe una estabilidad térmica y resistencia a la degradación comparables a contrapartes químicamente entrecruzadas, manteniendo la integridad estructural bajo condiciones fisiológicas mientras apoya una viabilidad celular robusta e interacciones favorables entre célula y material.

Los resultados de la digestión enzimática, que indican una degradación reducida en muestras reticuladas, coinciden con la mejora observada en propiedades mecánicas y térmicas, corroborando la eficacia de la reticulación para reforzar la resiliencia de la ma-trix. Sin embargo, la robustez mecánica y la reducción de la degradabilidad, como se observa inXcol_EDC/NHS y Xcol_Genipin, pueden ser un obstáculo para el delicado equilibrio necesario para la regeneración de tejidos. Estas matrices muestran una degradación enzimática limitada y una mayor resistencia térmica, pero esta durabilidad podría dificultar temporalmente la remodelación de tejidos naturales, como indica su menor viabilidad celular.

En el ámbito de la ingeniería de tejidos, donde se espera que la degradación de los pliegues de andamiaje abra el camino para nuevas formas de tejido, se prefieren materiales como Xcol_UVA/R que logran un equilibrio óptimo entre estabilidad y degradabilidad. Facilitan las funciones celulares sin provocar una respuesta inflamatoria prolongada, mejorando así los resultados de la curación. En resumen, la elección del método de reticulación intercalada impacta profundamente en el rendimiento del andamio, con la reticulación UVA/R emergiendo como un enfoque prometedor para crear andamios biocompatibles, estables y degradables, propicios para aplicaciones exitosas de ingeniería de tejidos.

2.4. Evaluación histológica de implantes subcutáneos

La excepcional biocompatibilidad y osteoconductividad de la generación colosal la convierten en una piedra angular para aplicaciones de injertos óseos. Sin embargo, su utilidad ha estado históricamente limitada por la estabilidad biomecánica. Mediante la aplicación de un innovador proceso de reticulación UVA/R, hemos abordado con éxito esta limitación, mejorando significativamente la estabilidad mecánica de nuestros pliegues de colágeno. La integración de sustitutos óseos inorgánicos (BS), como la hidroxiapatita y la β-TCP, proporciona el soporte mecánico necesario para la remodelación ósea a largo plazo, aunque carece de los componentes ECM cruciales para las interacciones celulares tempranas y la degradabilidad de los pliegues de escaf.

Por tanto, nuestro innovador andamio compuesto inyectable con matriz de colágeno cruzada UVA/R y BS, está diseñado para optimizar tanto el compromiso inicial de las células como la remodelación ósea duradera. Mediante evaluaciones subcutáneas y evaluaciones histológicas descentralizadas de los andamios implantados, hemos alcanzado una comprensión matizada de la integridad del material y la dinámica de la respuesta a la cirugía. Esto incluye un análisis en profundidad de las reacciones tisulares, especialmente las respuestas inmunitarias, para determinar la biocompatibilidad y obtener conocimientos críticos para futuras aplicaciones. Este enfoque metódico subraya nuestro compromiso de explorar a fondo la interacción entre nuestras matrices diseñadas y los sistemas biológicos.

2.4. 1. Análisis de reacciones tisulares

La tinción por Pentacromo de Movat es una técnica histológica polivalente que marca de forma distintiva diversos componentes del tejido connéctivo, facilitando su diferenciación en secciones histológicas. En este estudio, se analizó la tinción con pentacromo de Movat para distinguir visualmente y analizar de forma semicuantitativa la distribución de GAG y colágeno en las secciones del tejido, revelando los comportamientos distintivos de los andamios implantados no reticulados de colágeno y UVA/R (BS-Col y BS-Xcol_UVA/R) dentro del entorno tisular (Figuras 6A–C). Al décimo día tras la implantación, ambos grupos mostraron matrices de colágeno dentro de los lechos de implantación (Figura 6B).

Cabe destacar que el grupo BS-Xcol_UVA/R demostró una adherencia notable a la superficie de sustituto óseo en contraste con la matrix vagamente asociada observada en el grupo BS-Col, lo que sugiere una mayor estabilidad matricial potencialmente conferida por el proceso de reticulación UVA/R. El análisis cuantitativo corroboró aún más estos hallazgos, indicando un mayor contenido de colágeno en los sitios de implantación BS-Xcol_UVA/R en comparación con BS-Col (Figura 6C), lo que podría demostrar el profundo efecto del entrecruzamiento en la integridad de la matriz. A medida que avanzaba la formación del tejido, los niveles inicialmente similares de cosaminoglicanos (GAG) tomaron un giro considerable, mostrando una disminución con el tiempo, lo que sugiere una respuesta tisular continua, actividad celular y un proceso dinámico de remodelación de la matriz a lo largo del tiempo.

Para el día 30, el grupo BS-Xcol_UVA/R mostró una notable retención del contenido de colágeno, con la matriz persistiendo alrededor de las superficies de sustituto óseo. Esta presencia sostenida, validada mediante análisis cuantitativo, puso de manifiesto los efectos duraderos del entrecruzamiento UVA/R sobre la estabilidad de la matriz. (Figura6C) El tejido dentro de los andamios había madurado, como lo demuestra el aumento de la vascularización en ambos grupos. Sin embargo, se observó un perfil inmunitario distinto; el grupo BS-Col mostró una mayor prevalencia de macrófagos y células gigantes multinucleadas, lo que sugiere una respuesta continua a la degradación del andamio.

2.4.2. Evaluación de la respuesta inmune

Nuestra exploración histológica de las respuestas inmunitarias en los sitios de implantación subcutánea reveló interacciones matizadas entre las defensas del huésped y los compuestos basados en la matriz de colágeno implantados. Inicialmente, al día 10, los macrófagos proinflamatorios CD11c-positivos eran prominentes alrededor de los implantes.

Figura 6.  Reacción tisular in vivo y respuesta inmunitaria a materiales basados en matriz de colágeno: BS-Col y BS-Xcol_UVA/R. A) Ilustración esquemática que representa el material compuesto inyectable compuesto por matriz de colágeno y sustituto óseo (BS), implantado subcutáneamente en el ratón BALB/c.

B) Imágenes histológicas representativas de las áreas de implantación de BS-Col y BS-Xcol_UVA/R en los días 10 y 30 tras la implantación usando la tinción Pen-tachrome de Movat. C) Cuantificación del Pentachrome de Movat mediante análisis de deconvolución de color usando ImageJ. Amarillo-verde = colágeno, verde-azul = glicosaminoglicano (GAG). Presentado como un porcentaje del área total teñida. D) Imágenes inmunohistoquímicas representativas de subtipos de macrófagos proinflamatorios (CD11c) y antiinflamatorios (CD163) en las áreas de implantación de los respectivos grupos. E) Análisis histomorfométrico (cuantitativo) de subtipos de macrófagos positivos para CD11c y positivo para CD163 en las áreas de implantación de los respectivos grupos utilizando ImageJ. Estrellas negras = sustituto óseo (BS), estrellas rojas = vasos recién formados, triángulo naranja = colágeno, triángulo verde = células gigantes multinucleares, triángulo amarillo = células CD11c-positivas, azul triángulo = CD163-positivas. Barra de escala = 100 μm.

En ambos grupos, con menos macrófagos antiinflamatorios positivos para CD163 en la periferia (Figura 6D). Las evaluaciones cuantitativas (Figura 6E) delimitaron aún más el paisaje inmunitario, mostrando una predominancia de macrófagos M1 (CD11c- positivos) sobre los M2 (CD163-positivos) en el grupo BS-Col, con recuentos celulares de 153,3 ± 29,0 células/cm2 y 50,0 ± 14,7 células/cm2, respectivamente. En contraste, el grupo BS-Xcol_UVA/R mostró menos macrófagos M1 (122,0 ± 30,5 células/cm2) y una mayor incidencia de macrófagos M2 (79,9 ± 24,2 células/cm2), lo que sugiere una respuesta proinflamatoria moderada.

Para el día 30, se observó un cambio perceptible en la polarización de los macrófagos. El grupo BS-Col mantuvo una fuerte expresión de CD11c (173,0 ± 42,1 células/cm2) en la zona del implante, con una escasa expresión de CD163. En contraste, el grupo BS-Xcol_UVA/R demostró un aumento notable en macrófagos antiinflamatorios CD163-positivos (115,0 ± 23,9 células/cm2) y una re-ducción en la expresión de CD11c (76,5 ± 17,9 células/cm2), tal como se indica en la Figura 6E. Este cambio indica una inclinación significativa hacia un fenotipo antiinflamatorio en el grupo BS-Xcol_UVA/R, con un marcado cambio respecto al ambiente persistente proinflamatorio del grupo BS-Col.

La evaluación histológica de los implantes subcutáneos ofrece evidencia convincente de la eficacia del entrecruzamiento UVA/R del proceso de reticulación UVA/R para mejorar la bioestabilidad e integración de matrices de colágeno en un entorno biológico.   La presencia temprana de macrófagos proinflamatorios, que pasa a un perfil antiinflamatorio en el grupo BS-Xcol_UVA/R, indica una respuesta inmunitaria aguda típica, esencial para la cicatrización de heridas y la integración del implante. La reducción de la degradación y la presencia de colágeno oxidado de tirosina (DOPA) reticulado tras el tratamiento con UVA/R probablemente contribuyen sinérgicamente a los efectos antiinflamatorios. DOPA, que también fue uno de los productos incluidos en péptidos contenidos en tirosina tras el tratamiento con UVA/R (Figura 3B), desempeña un papel importante en la mitigación de la inflamación, lo que podría mejorar la biocompatibilidad de los andamios de los colagen.

Esto abre vías para una investigación adicional sobre biomateriales fotoquímicamente entrecruzados en la ingeniería tisular y la medicina regenerativa, especialmente en la comprensión y aprovechamiento de estos mecanismos para el control de las re-sponses inmunitarias en la integración clínica y funcionalidad de implantes. Aunque nuestro estudio ofrece una visión completa sobre la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas, futuras investigaciones que incorporen el análisis de generación de segundo armónico (SHG) podrían ofrecer una comprensión adicional de los cambios ultraestructurales en la fibrilabilidad colo-gen, enriqueciendo nuestra exploración del colágeno fotoquimicamente reticulado para la ingeniería tisular y la medicina regenerativa.

El proceso optimizado de reticulación UVA/R mejora la integración de nuestros andamios de col-lagen con materiales BS, creando una solución altamente eficaz para el injerto óseo. Este enfoque innovador no solo refuerza la estabilidad biomecánica, sino que también maximiza la biocompatibilidad del material compuesto, lo que lo hace muy adecuado para aplicaciones clínicas. Al incorporar materiales inorgánicos en la matriz de colágeno, abordamos la necesidad esencial de un soporte mecánico duradero, fundamental para una regeneración y remodelación ósea exitosa. Lo fundamental es que nuestro método potencia las interacciones iniciales entre células y andamios, un elemento clave en la ingeniería de tejidos, al tiempo que proporciona el soporte mecánico vital para la regeneración ósea.

Más allá de la regeneración ósea, la versatilidad del colágeno reticulado UVA/R se extiende a una amplia gama de aplicaciones. Sirve como material fundamental para la reparación del cartílago, donde su capacidad para soportar la adhesión y proliferación de condrocitos puede ser crítica. En la cicatrización de heridas, su excelente biocompatibilidad y entorno productivo para la migración celular aceleran la reparación de tejidos.

Para la ingeniería de tejidos vasculares, el andamiaje apoya el crecimiento de células endoteliales y musculares lisas, esenciales para formar vasos sanguíneos funcionales.  En la regeneración nerviosa, el andamiaje puede guiar el crecimiento de la neurita, ofreciendo una vía prometedora para reparar lesiones nerviosas. Además, las tasas de degradación adaptadas del material y su compatibilidad con diversos agentes bioactivos lo convierten en un excelente candidato para sistemas de administración dirigida de fármacos y liberación controlada.

Para desbloquear todo el potencial de estos materiales en entornos clínicos, es esencial una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes. Las tecnologías avanzadas de imagen y espectroscopía desempeñarán un papel crucial en esta exploración, ofreciendo información sobre la interacción del andamiaje con los tejidos biológicos y su impacto en el comportamiento celular. Este conocimiento profundo es fundamental para adaptar los materiales a las demandas específicas de diversas aplicaciones de medicina regenerativa, asegurando resultados optimizados para la reparación y regeneración de tejidos.

3. Conclusión y perspectivas

La intrincada interacción entre la complejidad de la molécula de colágeno y el misterioso proceso foto-químico de entrecruzamiento UVA/riboflavina (UVA/R) es un fascinante enigma que nuestro estudio ha desentrañado hábilmente. Nuestra investigación exhaustiva sobre el mecanismo de reticulación del colágeno utilizando seis péptidos sintéticos seleccionados estratégicamente ha dado resultados notables.  El HPLC y el LC-MS revelan de forma constante una preferencia por la ty-rosina entre los aminoácidos, una revelación que avanza significativamente en nuestra comprensión de la técnica de reticulación UVA/R, muy empleada, especialmente en oftalmología.

La orientación preferencial de la tirosina arroja luz sobre las vías moleculares específicas implicadas en la estabilización del colágeno inducida por rayos UV. Nuestros hallazgos subrayan el papel de la tirosina en la reticulación inducida por rayos UV y el grupo fenol en la tirosina también es susceptible a la fotoactivación, ofreciendo posibles estrategias de ingeniería para biomateriales artificiales o funcionalizados. Más allá de la eluci-datación de los mecanismos de la reticulación UVA/R, los resultados sugieren un papel crucial de la tirosina en el diseño y evaluación de biomateriales basados en colágeno y además provocan una reevaluación de materiales existentes, especialmente aquellos modificados químicamente debido a la reticulación dominada por tirosina, planteando preguntas pertinentes tanto para solicitantes como para agencias reguladoras.

El enfoque de la aproximación presentado en este estudio también aboga por la necesidad de reevaluar y optimizar la técnica de reticulación UVA con un enfoque en maximizar la controlabilidad de la reacción, como la implicación de residuos de tirosina definidos en el proceso mediante condiciones de reacción controladas. A través del desarrollo de péptidos sintéticos que reflejan posibles sitios de reticulación, hemos descubierto la influencia crítica de los residuos de tirosina en el mecanismo de reticulación, especialmente aquellos que residen en regiones no helicoidales vitales para aumentar las propiedades mecánicas. Nuestros estudios in vivo en ratones BALB/c han confirmado la biocompatibilidad y eficacia funcional del colágeno entreticulado UVA/R, respaldando su potencial superior como biomaterial para uso terapéutico.

Wu Xi Further Pharmaceutical Co., Ltd

Productos principales

Micro de palmitoiletanolamida (PEA) (CAS 544-31-0)

Tricloruro de espermidina (CAS 334-50-9)

Pterostilbeno (CAS 537-42-8)

Luteolin (CAS 491-70-3)

Voglibose (CAS 83480-29-9) JP GMP

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